连续流动分析仪（流动之星I）测定白酒中氰化物的方法验证

分类：公司发展 作者：上海宝中盈 来源： 日期：2024/01/25

【摘要】： 1本研究主要采用了上海伏米科技流动之星I连续流动分析仪，采用连续流动法测定白酒中氰化物，对国家标准方法《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）来进行方法验证。

摘要：本研究主要采用了上海伏米科技流动之星I连续流动分析仪，采用连续流动法测定白酒中氰化物，对国家标准方法《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）来进行方法验证，本实验测定目标有标准曲线、空白样品、实际市售白酒样品以及加标回收率等，结果表明: 标准曲线、方法检出限及定量限、精密度及加标回收等指标均满足方法要求，表明合理使用连续流动分析仪来测定白酒中的氰化物含量时，操作难度较低且能满足实际检测的多样性、微量性，并得到准确结果。

关键词：连续流动分析仪；氰化物；白酒；方法验证

Abstract: In this study mainly used the Shanghai Fumi Technology Flow Star I continuous flow analyzer to measure cyanide in Baijiu and conducted method verification on the national standard method "National Food Safety Standard Determination of Cyanide in Foods" (GB 5009.36-2023).

Abstract: In this study mainly used the Shanghai Fumi Technology Flow Star I continuous flow analyzer to measure cyanide in Baijiu and conducted method verification on the national standard method "National Food Safety Standard Determination of Cyanide in Foods" (GB 5009.36-2023). and the standard curve，standard substance，blank sample，actual sample and standard addition were measured. The results show that: standard curve，detection limit，accuracy，precision and other indicators meet the requirements of the method. It shows that when the continuous flow analyzer is used rationally to measure the cyanide content in Baijiu, the operation difficulty is low, and it can meet the diversity and traceness of actual detection and obtain accurate results.

Key words: continuous flow analysis; cyanide; Baijiu; verification of the method

1 引言

       氰化物（Cyanide）是特指含有氰基（-CN）或者氰离子（CN-）属于高毒类的化合物，急性氰化物中毒时氰化物会受到胃酸的作用影响，水解生成氰氢酸而被吸收进入血液。在细胞色素C氧化酶中的三价铁（Fe3+）与血液中的氰根产生结合，从而形生成氰化高铁细胞色素氧化酶，这导致Fe3+失去传输电子的功能，进而导致了呼吸链的中断，阻止细胞呼吸而死亡^[1]。由于白酒中的主要原料是以木薯和野生植物为主所酿制的，在发酵过程中会水解而产生氢氰酸，因此，这种酒的氰化物含量相对较高。然而，由谷物原料所酿制成的酒中氰化物含量则非常微量。尽管大部分产生的氢氰酸在原料的蒸煮过程中可以通过排气挥发掉，但仍有少部分的氢氰酸残留在白酒中^[2]。此外，农药的使用一部份污染了原料，以及酿酒过程中的变异反应都是可能导致氰化物污染的原因^[3]。

     《食品安全国家标准 蒸馏酒及其配制酒》（GB 2757-2012）^[4]中规定了氰化物限量应小于8.0 mg/L（以HCN计，按100 %vol酒精度折算）。目前，白酒中氰化物的主要检测方法有分光光度法、滴定分析法、电化学检测法、气相色谱法以及连续流动分析法等。相对于其他检测方法耗时长、误差大、检测结果不稳定等问题，连续流动分析法实现了氰化物的自动化检测，能够避免手动操作的不稳定因素，同时也能够节省大量的时间，提升精度，并且减少对于白酒基质的影响。因此，本文根据目前最新的白酒中的氰化物检测标准《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）^[5] 进行方法验证，以证明其准确性、精密度等等满足白酒中氰化物的检测，以利大批量的样品分析检测工作。

2  原理

2.1 方法原理

       由于白酒试样中氰化物的碱解反应发生在酸性环境（PH=3.8），因此，通过125℃在线蒸馏可將氰化物水解成氢氰酸的形式蒸馏出。此時气态的氢氰酸會被氢氧化钠溶液吸收，然后，在弱酸性的环境下，氰离子和氯氨Ｔ发生反应，生成氯化氰，接着与异烟酸（Isonicotinic acid）進行反应，最后经過水解生成戊烯二醛（Pentenedialdehyde），戊烯二醛与两个1,3-二甲基巴比妥酸（1,3-Dimethylbarbituric acid）分子缩生合反应生成红色络合物（反应机理如图1所示），在波长为600 nm处对该红色落合物有最大吸收，之后进入比色池定量测定（白酒中氰化物的方法分析工作流程见图2），与标准系列比较定量。方法的线性范围为0.002~1000 mg/L CN-，检出限为0.015 mg/L CN-，对于浓度高于上述测定上限的檢測樣品，可以适当的進行稀释后再测定，样品分析频率为22样1 h。

图1异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定白酒试样中氰化物反应肌理

图2 连续流动-异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定白酒试样中氰化物流程

2.2 仪器原理

       由上海伏米科技有限公司生产的流动之星I连续流动分析仪运用了并流技术，通过蠕动泵來挤压弹性聚乙烯（PE）泵管，将一定比例的樣品试样、试剂以及空气注入封闭的管路反应系统中，从而确保了空气气泡的間隔分布均匀与稳定，使实验结果能够有效重现且精準。空气氣泡分割技术使得各個片段都能够保持完好，降低了扩散和样品带过，同时能够使管路内的表面得到清洁的作用，此外，气泡的分布情况也可以准确地揭示出全部系统问题的根源[7]。

       管路流动的过程中试样与试剂能够被平稳地混合，产生化学作用。实现均匀混合并发生化学反应，在化学分析模块中，基本上都将会配置一个或以上的在线处理装置，从而更加方便地实现在线蒸馏、萃取以及加热等的各种处理，而后生成待检测的物质，流入检测模块（比色池）进行比色检测，仪器记录每一时段不同的信号变化，由软件自动计算浓度值。和手工操作相比，样品在线处理使得分析过程的效率得到了有效提高，同时还使得分析的可靠性得到加强，有助于人力、物力的节约，减少样品和试剂的消耗量还有实验废液的产量，可为大量样品提供快速、准确的分析大量样本中的少量化学物质。

        流动之星I连续流动分析仪在对样品进行测定的过程中，能够选择通过单一化学反应模块来针对一个参数实施测定，或并联两个或多个化学反应模块， 针对这些模块实施同时的测定，从而实现更高的分析效率，提高测试的速度。

3  实验部分

3.1 仪器与试剂

3.1.1 主要试剂、材料与仪器

       实验过程中用的试剂见表1，实验装置明细见表2。

表1 试剂与材料

表2 实验装置明细表

3.1.2 试剂配制

       本方法所用试剂均为分析纯及以上，使用的水为经 Aquaplore 2S超纯水机处理的超纯水。

3.1.2.1 异烟酸/巴比妥酸显色剂（R1）

       称取4.4g氢氧化钠溶于400mL水，待其完全溶解，称取6.8g 1,3-二甲基巴比妥酸加入其中，待超声溶解完全后称取6.8g异烟酸搅拌溶解。用0.5mol/L的氢氧化钠调pH值至5.5，稀释至500mL。在30℃ 下剧烈地搅拌（如使用磁力搅拌器）1小时然后过滤，可在5℃下稳定三个月。

3.1.2.2 氯胺-T溶液（R2）

       称取1g氯胺-T溶于400mL超纯水中，稀释至500mL，放置于棕色玻璃瓶中待溶液混均稳定一周。

3.1.2.3缓冲溶液（R3）

       称取13.6g磷酸二氢钾和0.34g磷酸氢二钾超声溶解于800mL超纯水，用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH值至5.2，用超纯水稀释至1000mL，最後加入3.0 mL 30%的Brij35溶液混均，放置于棕色玻璃瓶中在4℃ 下稳定三个月。

3.1.2.4吸收试剂（0.1N氢氧化钠）（R4）

       称取4g氢氧化钠超声溶解于500mL超纯水，稀释至1000mL。

3.1.2.5 蒸馏试剂（R5）

       量取250mL磷酸加入500mL超纯水中，加入50mL次磷酸混合均勻，用超纯水稀释至1000mL。

3.2 样品前处理

       根据《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）第五法流动注射/连续流动-分光光度法中，对于蒸馏酒及其配置酒以及食用酒精的样品前处理方法如下，准确吸取1.00 mL试样（其中芝麻香型白酒、酱香型白酒、特香型白酒试样吸取0.25 mL）于25 mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液（1 g/L）定容至刻度混匀，放置10 min后，样品碱解后进样测定。由于本实验仅采用米香型、清香型、浓香型等三种香型，因此，皆是使用稀释倍数为25的方法进行样品前处理。

3.3 实验

3.3.1 标准曲线的配制

        取水中氰化物标准溶液10.00mL于100mL容量瓶中，用0.01N NaOH溶液定容至标线，得到浓度为5.00mg/L的标准中间液；移取20.00mL标准中间液，同样使用0.01N NaOH溶液定容至100mL容量瓶中，得到浓度为1.00mg/L的标准使用液；取一组100mL容量瓶，移取0.00mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL和10.00mL的标准使用液，分别加入容量瓶中，用0.01N NaOH溶液定容至标线，浓度分别为0.00 mg/L、0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L，待用。

3.3.2 仪器条件

        连续流动分析仪是由自动进样器、高精度蠕动泵、化学反应单元、比色计检测单元、数据处理单元等组成，总氰化物测定的仪器条件如下表3所示。

表3 流动之星I连续流动分析仪白酒中氰化物测定仪器条件

3.3.3 测定步骤

      （1）将流动之星I连续流动分析仪的空气管、废液管、清洗管等连接到指定位置后，连接流动之星I以及进样器与计算机之间的数据线。

      （2）打开进样器、流动之星I检测器开关，启动计算机，在“资源管理器”中查看“端口”确定已成功连接，启动软件选择对应端口。

      （3）启动冷却循环槽，先开电源开关，再开制冷及蒸馏器加热开关开始加热；检查管路连接是否正确，盖上泵盖，启动泵并吸取试剂。

      （4）点击“增加”按键增添样品数量来，设置完成后再点击“运行”键，最后输入文件名保存新建项目。

      （5）运行结束先关闭蒸馏器及加热器温度已进行降温，再将所有试剂管路从试剂瓶中取出，将管壁擦干或用超纯水冲洗干净后放入超纯水清洗10min。

      （6）清洗后关闭蠕动泵并开启泵盖释放泵管压力，关闭流动之星I、进样器以及冷却循环槽开关，实验结束。

4 结果与讨论

4.1  标准曲线及方法检出限

4.1.1 标准曲线

       将水中氰化物标准溶液浓度作为横坐标，峰高作为纵坐标，通过软件计算得出标准曲线与相关系数，具体可见表4。通过实验结果可知，根据《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）通过异烟酸-巴比妥酸连续流动法来针对白酒中氰化物进行测定，质量浓度在0~0.100mg/L（50mm比色池）范围内表现出了较好的线性关系，相关系数 r=0.9999。

表4 测定白酒中氰化物的标准曲线方程及相关系数r

4.1.2 方法检出限

       本方法检出限实验根据《环境监测分析方法标准制订技术导则》（HJ168-2020）附录A方法特性指标确定方法^[6]，按照标准中样品分析的全部步骤，对浓度值或含量为估计方法检出限3~5倍的样品进行n（n≥7）次平行测定，计算n 次平行测定的标准偏差，按公式（1）计算方法检出限。 

MDL = t_(n-1,0.99) × S   （1）

式中：MDL - 方法检出限；

n - 样品的平行测定次数；

t - 自由度为n-1，置信度为99%时的t分布值（单侧）；

S - n次平行测定的标准偏差。

      根据标准本次实验选择测定8次浓度為0.001 mg/L的标准，当 n=8时 ，t_(n-1，0.99)=2.998^[6]。检出限测定结果如表5所示，计算标准偏差为0.039251，计算得出最低检出限为0 .12μg/L，根据所验证的标准方法规定，定量限为 4 倍的方法检出限，得出定量限为0.47μg/L。低于《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）所要求的方法检出限0.015mg/L（15μg/L），定量限 0.050mg/L（50μg/L）。

表5 测定总氰化物的检出限测定结果

4.2 方法精密度测试

       本实验分采用有证标准物质配制低浓度 0.005mg/L（1μg/L）、中浓度0.020mg/L（20μg/L）、及高浓度0.100mg/L（100μg/L）共3个浓度梯度，其中，低浓度目的是测定下限附近浓度，中浓度是取校准曲线的中间点附近浓度而高浓度则是取校准曲线中线性范围上限附近的浓度，此外，取5种酒样做检测，分别对各浓度及酒样按照方法的分析步骤和仪器条件进行6次重复性实验。此处白酒样品根据《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）中，试样中氰化物（以CN-计）含量需将原始实测值放大25倍，下表呈现为未放大的原始实测值。

表6 测定白酒样品方法精密度（n=6）

       测定结果如表6所示，低、中、高3种浓度RSD（%） 结果在0.36%~3.10%范围内，5组不同浓度市售白酒样品所测试的RSD（%）结果在0.36%~ 3.82%范围内，均符合方法要求。

4.3 加标回收试验

      按《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）方法条件对市场上售卖的不同类型的白酒进行稀释检测分析，其中S1为米香型（酒精浓度为28%vol），S2为清香型（酒精浓度为35%vol），S3、S4、S5为浓香型（酒精浓度分别为42%vol、52%vol、70%vol），不同酒样中检测出少量本底值，试样中氰化物（以CN-计）含量为原始实测值放大25倍。对检出待测物不同类型白酒以及浓度做加标回收试验，平行测定6次，加标量为0.005mg/L以及0.020mg/L，结果显示，加标回收率在86.3%~109.4%范围内，此外，计算相对标准偏差（RSD）结果在0.44~2.45范围内，说明该方法具有可靠性和准确性，结果见表7。

表7 测定白酒样品加标回收率、精密度

5 小结

5.1标准曲线评价

    本次实验绘制的标准曲线相关系数r=0.9999，满足所验证方法《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）r≥0. 999 的要求。

5.2检出限及定量限评价

     本次实验计算出方法检出限为0.12μg / L，定量限为0.47 μg/L，检出限低于所验证方法要求的方法检出限0.015mg/L（15μg/L），定量限0.050mg/L（50μg/L）。

5.3方法精密度测试评价

     根据测定结果可知，低、中、高3种浓度相對标准偏差RSD（%）結果在0.36%~3.10%範圍內，5组不同濃度市售白酒样品所測试的RSD（%）结果在0.36%~ 3.82%範圍內，均符合方法要求。

5.4加标回收试验评价

     根据测定结果可知，加標量為0.005mg/L以及0.020mg/L時，不同类型白酒以及濃度的加标回收率分别在86.3%~97.4%以及88.8%~109.4%，测定结果满足所验证方法要求。

5.5结论

     本实验使用上海伏米科技有限公司生产的流动之星I连续流动分析仪对国家标准方法《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》（GB 5009.36-2023）进行方法验证，对所有的测试参数，如标准曲线、方法检出限、准确度和精密度，都达到了方法的规定，从结果来看流动之星I连续流动分析仪的自动进样、自动分析的过程能够有效避免传统方法实验中人为误差及安全性，测定过程简单且试剂药品用量少，能够通过此方法来对大批量样品进行测定，更能满足实际检测的多样性、微量性，并得到准确结果。

参考文献：

[1] LOGUE B A, HINKENS D M, BASKIN S I, et al. The analysis of cyanide and its breakdown products in biological samples [J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2010, 40(2): 122-47.

[2] 魏云, 杨红文, 邵栋梁, et al. 白酒中氰化物检测影响因素分析 [J]. 酿酒, 2013, 40(02): 60-2.

[3] 徐兴江. 白酒中氰化物来源分析与处理方法 [J]. 酿酒科技, 2017, (10): 90-1.

[4] 中华人民共和国卫生部. 食品安全国家标准 蒸馏酒及其配制酒: GB 2757—2012 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2012:

[5] 国家卫生和计划生育委员会 国, 总局. 食品安全国家标准 食品中氰化物的测定: GB 5009.36-2023 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2023:

[6] 中华人民共和国国家环境保护部. 环境监测分析方法标准制订技术导则: HJ 168-2020 [S]. 北京: 中国环境出版社, 2020: 

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